Pregabalinas nėra GABAA ar GABAB receptorių agonistas.
Pregabalinas yra gabapentinoidas ir slopina tam tikrus kalcio kanalus. Tiksliau, tai yra tam tikrų nuo įtampos priklausomų kalcio kanalų (VDCC) pagalbinio α2δ subvieneto vietos ligandas, todėl veikia kaip α2δ subvieneto turinčių VDCC inhibitorius. Yra du vaistus surišantys α2δ subvienetai, α2δ-1 ir α2δ-2, o pregabalinas pasižymi panašiu afinitetu (taigi ir selektyvumo stoka) šioms dviem vietoms. Pregabalinas yra selektyvus jungiantis prie α2δ VDCC subvieneto. Nepaisant to, kad pregabalinas yra GABA analogas, jis nesijungia su GABA receptoriais, nevirsta GABA ar kitu GABA receptorių agonistu in vivo ir tiesiogiai nemoduliuoja GABA transportavimo ar metabolizmo. Tačiau nustatyta, kad pregabalinas sukelia nuo dozės priklausomą L-glutamo rūgšties dekarboksilazės (GAD), fermento, atsakingo už GABA sintezę, ekspresijos padidėjimą smegenyse, todėl gali turėti tam tikrą netiesioginį GABAerginį poveikį, padidindamas GABA kiekį smegenyse. Šiuo metu nėra įrodymų, kad pregabalino poveikį sąlygotų koks nors kitas mechanizmas, išskyrus α2δ turinčių VDCC slopinimą. Atitinkamai, α2δ-1 turinčių VDCC slopinimas pregabalinu, atrodo, yra atsakingas už jo prieštraukulinį, analgetinį ir anksiolitinį poveikį.
Endogeninės α-aminorūgštys L-leucinas ir L-izoleucinas, kurios chemine struktūra labai primena pregabaliną ir kitus gabapentinoidus, yra α2δ VDCC subvieneto ligandai, kurių afinitetas panašus kaip gabapentinoidų (pvz., IC50 = 71 nM L- izoleucinas) ir yra žmogaus smegenų skystyje mikromoliarais koncentracijos (pvz., 12,9 μM L-leucinui, 4,8 μM L-izoleucinui). Buvo iškelta teorija, kad jie gali būti subvieneto endogeniniai ligandai ir kad jie gali konkurenciškai antagonizuoti gabapentinoidų poveikį. Atitinkamai, nors gabapentinoidai, tokie kaip pregabalinas ir gabapentinas, turi nanomolinį afinitetą α2δ subvienetui, jų stiprumas in vivo yra mažame mikromoliniame diapazone, ir buvo teigiama, kad konkurencija dėl endogeninių L-aminorūgščių surišimo gali būti atsakinga už šį neatitikimą.

Viename tyrime nustatyta, kad pregabalinas turi 6 kartus didesnį afinitetą nei gabapentinas α2δ subvienetų turintiems VDCC. Tačiau kitame tyrime nustatyta, kad pregabalinas ir gabapentinas turi panašų giminingumą žmogaus rekombinantiniam α2δ-1 subvienetui (Ki = 32 nM ir 40 nM, atitinkamai). Bet kuriuo atveju pregabalinas yra 2–4 ​​kartus stipresnis nei gabapentinas kaip analgetikas, o gyvūnams – 3–10 kartų stipresnis nei gabapentinas kaip prieštraukulinis vaistas.